DHE-RP,超氧化物特异性探针

一、DHE-RP超氧化物荧光探针属性：
化学属性：该探针为有机荧光小分子，分子结构含可被 O2??特异性攻击的脱氢位点，同时带有核酸结合基团（如插嵌基团或静电结合基团），未激活时荧光量子产率极低，呈 “荧光淬灭” 状态。
特异性优势：与常规活性氧探针不同，其识别位点仅对 O2??的电子转移特性敏感，对?OH 的强氧化性、1O2的亲电加成特性均无直接响应，可有效排除两种活性氧的检测干扰。
荧光性能：未被激活时无明显荧光；经 O2??脱氢并与核酸结合后，发射红色荧光，激发波长与发射波长通常分别约为518nm和606 nm（具体数值随实验体系（如 pH、溶剂）略有波动，建议以实际测试为准）。

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二、反应原理：
1. O2?-介导的脱氢反应（激活关键）
探针分子中的活性氢供体基团（如酚羟基、氨基取代的烯丙基等）为 O2?-的特异性作用位点。O2?-作为弱氧化剂，通过电子转移方式夺取该位点的活性氢，使探针分子发生氧化脱氢，生成具有共轭双键的活性中间体。此过程为不可逆反应，且仅能由 O2?-触发，?OH、1O2无法实现该脱氢机制。
2.与核酸结合并产生红色荧光
脱氢后的活性中间体因共轭体系扩展，具备了与核酸（DNA/RNA）结合的结构基础，主要通过插嵌作用（嵌入核酸双链的碱基对之间）或静电相互作用（与核酸磷酸骨架结合）与核酸结合。结合后，探针分子的分子构象趋于稳定，荧光量子产率大幅提升，最终在特定激发光下发射红色荧光，荧光强度与体系中 O2?-的浓度呈正相关（在一定浓度范围内）。

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荧光光谱

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三、通用实验方法（细胞外 / 细胞内检测）
以下为该 DHE-RP 常规实验操作流程，可根据研究场景（如体外体系、细胞模型）调整参数，核心需控制探针浓度、孵育时间及活性氧干扰。
1.实验前准备
试剂配制
探针储备液：取适量 DHE-RP 粉末，用DMSO溶解，配制成 10~20 mM 的储备液，分装后于 - 20℃避光保存，有效期 6 个月（避免反复冻融）。
探针工作液：实验前用缓冲液（如 PBS、HEPES，pH 7.2~7.4）将储备液稀释至5~20 μM，现配现用，全程避光。
阳性对照：超氧阴离子发生剂（如黄嘌呤 - 黄嘌呤氧化酶体系，X/XOD）；阴性对照：超氧阴离子清除剂（如超氧化物歧化酶，SOD，200~500 U/mL）。
实验材料：缓冲液（PBS/HEPES）、荧光酶标仪 / 激光共聚焦显微镜、离心管 / 96 孔板 / 细胞培养皿、移液枪（避光吸头）。
方法 1：细胞外体系 O???检测（96 孔板法，荧光酶标仪）
适用于体外溶液中 O???的定量检测，如酶促反应体系、药物诱导的自由基生成体系。
向 96 孔黑色避光板中加入反应缓冲液（如 PBS），每孔 80 μL。
加入探针工作液，每孔 10 μL，轻轻吹打混匀，室温避光孵育 5 min。
加入待检测样品（或阳性 / 阴性对照），每孔 10 μL，使体系终体积为 100 μL，探针终浓度为 0.5~2 μM。
室温避光孵育15~30 min，用荧光酶标仪检测荧光信号：激发波长设为 518~570 nm，发射波长设为 580~620 nm，记录每孔的相对荧光强度（RFU）。
数据处理：以阴性对照孔的荧光强度为基线，计算样品孔的相对荧光值，结合标准曲线（若需定量）确定 O???浓度。
方法 2：细胞内 O???检测（激光共聚焦显微镜法）
适用于活细胞内 O???的定位与定性检测，需保证细胞活性，全程避光操作。
细胞培养：将对数生长期的细胞接种于共聚焦培养皿中，密度为 5×10?~1×10?个 / 皿，置于 37℃、5% CO?培养箱中培养 24 h，使细胞贴壁。
探针孵育：吸除培养基，用预温的 PBS 轻轻洗涤细胞 2 次，加入含5~10 μM探针工作液的无血清培养基，37℃、5% CO?培养箱中避光孵育20~40 min。
洗涤：吸除探针培养基，用预温的 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 min，洗去未进入细胞的游离探针。
加样处理：加入含待检测刺激物（或阳性 / 阴性对照）的无血清培养基，继续孵育指定时间（如 10~60 min，根据刺激物起效时间调整）。
荧光成像：将培养皿置于激光共聚焦显微镜下，选择合适的激发光（518~570 nm），采集发射光（580~620 nm）的荧光图像，观察细胞内红色荧光的分布与强度。
对照设置：
空白对照：仅加细胞和无血清培养基，不加探针；
阴性对照：细胞孵育探针后，加入 SOD（终浓度 200 U/mL）再加入刺激物；
阳性对照：细胞孵育探针后，加入 X/XOD 体系（黄嘌呤终浓度 0.1 mM，黄嘌呤氧化酶终浓度 0.01 U/mL）。

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